|
Предсказание и проектирование макромолекулярных структур и взаимодействий
Введение
Проектирование структуры белка
Проектирование белок-белковых взаимодействий
Предсказание структуры белка
Предсказание белок-белковых взаимодействий
Улучшение физической модели
Планы на будущее
ВведениеЦель нашего текущего исследования состоит в том, чтобы разработать улучшенную модель внутри- и межмолекулярных взаимодействий и использовать эту модель для предсказания и проектирования макромолекулярных структур и взаимодействий. Приложения для предсказания и проектирования, которые могут представлять большой биологический интерес в их собственном праве, также обеспечивают строгие и объективные тесты, которые улучшают модель и увеличивают фундаментальное понимание.
Мы используем компьютерную программу по имени Розетта, чтобы выполнять вычисления белка и дизайна. В ядре Розетты имеются потенциальные функции для вычисления энергии взаимодействий в пределах и между макромолекулами, и методы для поиска структуры с самой низкой энергией для последовательности аминокислот (предсказание структуры белка) или комплекса белок-белок, и для поиска последовательности аминокислот с самой низкой энергией для белка или комплекса белок-белок (проектирование белка). Обратная связь от тестов предсказания и проектирования используется непрерывно, чтобы улучшить потенциальные функции и алгоритмы поиска. Развитие одной компьютерной программы для обработки этих разнообразных проблем имеет значительные преимущества: во-первых, различные приложения обеспечивают дополнительные тесты основной физической модели (фундаментальная физика / физическая химия, конечно, одна и та же во всех случаях); во-вторых, многие проблемы, представляющие текущий интерес, типа проектирования гибкого базового белка и стыковки белок-белок с базовой гибкостью, вовлекают комбинацию различных методов оптимизации.
Проектирование структуры белкаВ течение последних нескольких лет мы использовали наш вычислительный метод проектирования белка, чтобы существенно стабилизировать несколько маленьких белков, перепроектируя каждый остаток их последовательностей, чтобы перепроектировать устройство основы белка, преобразовать мономерный белок в strand-swapped dimer, и термостабилизировать фермент. Основным моментом была модернизация пути сворачивания белка G, маленького белка, содержащего две бета-шпильки, отделенные альфа-спиралью. В белке естественного происхождения, разрушена первая шпилька, а вторая шпилька сформирована на скорости, ограничивающей шаг в сворачивании. В перепроектированном варианте, в котором значительно стабилизирована первая шпилька и дестабилизирована вторая шпилька, порядок событий полностью изменен: первая шпилька сформирована, а вторая шпилька разрушена в состоянии сворачивающегося перехода. Способность перепроектировать сворачивающие белок пути рационально показывает, что наше понимание детерминантов сворачивания белка значительно продвинулось.
Рисунок 1: Проект белков и белок-белковых взаимодействий с высокой разрешающей точностью. Сравнение проектной модели и кристаллической структуры (слева) интерфейса новой разработанной эндонуклеазы с новой спецификой раскола ДНК, и (справа) вновь разработанный белок TOP7.
Левая группа, Таня Кортемм (Tanja Kortemme). Правая группа, Готам Дантас (Gautam Dantas). |
Особенно захватывающее с недавних пор - создание новых белков с произвольно выбранными трехмерными структурами. Мы развивали общую вычислительную стратегию для того, чтобы создать эти структуры белка, которая включает полную гибкость основы в оптимизацию ротамер-базирующейся последовательности. Это было достигнуто объединением в Розетте предсказания структуры белка методом ab initio, обработки энергии атомного уровня, и проектирования последовательности. Процедура использовалась для проектирования белка с 93 остатками по имени TOP7 с новой последовательностью и топологией. TOP7, как определили, был мономерным и свернут, и рентгенокристаллическая структура TOP7 удивительно похожа (RMSD = 1.2 Å; см. правую группу рисунка 1) на проектную модель. Проект нового шаровидного сворачивания белка и близкое соответствие кристаллической структуры с проектной моделью имеет широкие значения для проектирования белка и предсказания структуры белка и открывает дверь в исследование больших областей вселенной белка, еще не наблюдаемых в природе.
Проектирование белок-белковых взаимодействийЧтобы расширить эти методы на белок-белковые взаимодействия и особенно на модернизацию специфики взаимодействия, мы выбрали высоко-подобный комплекс из colicin E7 дезоксирибонуклеаза и ее родственного ингибиторного имунного белка в качестве системы-образца. Мы использовали физическую модель, описанную выше и модификацию нашей вычислительной проектной стратегии на основе поиска ротамеров, чтобы произвести новые пары белка ингибитора дезоксирибонуклеазы, предсказанных, чтобы сильно взаимодействовать друг с другом, но не с белками дикого типа. Разработанные белковые комплексы имеют субнаномолярные сходства, функциональные и определенные в естественных условиях, и имеют больше на порядок в различии свойств между родственными и неродственными парами в искусственных условиях. Этот подход должен быть применим к проектированию взаимодействующих пар белка с новыми спецификами для того, чтобы описать и воспроизвести сети взаимодействия белка в живых клетках.
В сотрудничестве с исследовательскими группами Барри Стоддарда (Barry Stoddard) и Рея Монната (Ray Monnat) (Исследовательский центр Рака Фреда Хачинсона - Fred Hutchinson Cancer Research Center), мы произвели искусственную, высокоспецифичную эндонуклеазу, плавя области возвращающихся эндонуклеаз I-DmoI и I-CreI с помощью вычислительной оптимизации нового интерфейса домен-домен между их обычно невзаимодействующими белками. Получившийся фермент, E-DreI (Engineered I-DmoI/I-CreI), связывает длинный химерный целевой участок ДНК с наномолярными свойствами, раскалывая его точно по норме, эквивалентной его естественным родителям. Мы в настоящее время пробуем произвести новые эндонуклеазы, расширяя нашу методологию проектирования на интерфейсы белок-нуклеиновая кислота, чтобы перепроектировать интерфейс белок-ДНК.
В обеих из этих систем было возможно определить рентгенокристаллические структуры разработанных комплексов. Как в случае TOP7, фактические структуры оказались очень похожими на спроектированные модели (рисунок 1, левая группа), что утверждает точность нашего подхода моделирования с высокой разрешающей способностью.
Предсказание структуры белкаКартина сворачивания белка, которая мотивирует наш подход в предсказании третичной структуры белка ab initio, - это то, что последовательно-зависимые местные взаимодействия смещают сегменты цепочки к типовым отличным наборам местных структур, и что нелокальные взаимодействия выбирают самые низкие свободно-энергетические третичные структуры из многих формаций, совместимых с этими местными уклонами. В осуществлении стратегии, предложенной этой картиной, мы используем различные модели, чтобы рассмотреть локальные и нелокальные взаимодействия. Вместо того, чтобы применять физическую модель для локальных отношений структура-последовательность, мы обращаемся к базе данных белков и берем распределение локальных структур, принятых короткими сегментами последовательностей (длиной меньше 10 остатков) в известных трехмерных структурах как приближение к распределению структур, выбранных изолированными пептидами с соответствующими последовательностями.
Рассматриваемые первичные нелокальные взаимодействия - hydrophobic burial, электростатика, водородная связь главной цепи, и исключенный объем. Структуры, которые являются одновременно совместимыми и с локальными уклонами структуры последовательности, и с нелокальными взаимодействиями, произведены при использовании моделируемого отжига, чтобы минимизировать нелокальную энергию взаимодействия в месте, определенном локальными структурными распределениями.
Рисунок 2: Слепые предсказания структуры белка от CASP3 и CASP4.
A: Слева кристаллическая структура фактора транскрипции MarA, связанного с ДНК; справа наша лучшая предложенная модель в CASP3. Несмотря на многие неправильные детали, полное сворачивание предсказано с достаточной точностью, чтобы позволить понять суть способа связывания ДНК.
B: Слева кристаллическая структура bacteriocin AS-48; в середине наша лучшая предложенная модель в CASP4; справа структурно и функционально связанный белок (NK-lysin), идентифицированный с использованием этой модели в поиске на основе структуры в Банке данных Белка (PDB). Структурное и функциональное подобие не распознаются с использованием методов сравнения последовательности (идентичность между двумя последовательностями - только 5 процентов).
C: Слева кристаллическая структура второй области MutS; в середине наша лучшая предложенная модель для этой области в CASP4; справа структурно связанный белок (RuvC) со связанной функцией, распознанной с использованием модели в поиске на основе структуры PDB. Подобие не было распознано с использованием сравнения последовательности или методов распознавания сворачивания.
Изображение: Рич Боннео (Rich Bonneau) |
Розетта была проверена в двухлетних экспериментах CASP (критическая оценка предсказания структуры), в которых предсказателям бросают вызов сделать слепые предсказания структур принятыми последовательностями белка, структуры которых были определены, но еще не изданы. Начиная с CASP3 в 1998, Розетта последовательно была главным методом выполнения для предсказания ab initio, как сообщено независимыми экспертами. В эксперименте CASP4, например, Розетта была проверена на 21 белке. Предсказания для этих белков, которые испытывают недостаток в обнаружимом подобии последовательности любому белку с предварительно определенной структурой, имели беспрецедентную точность и последовательность. (Некоторые примеры показаны на рисунке 2.) Превосходные предсказания были также сделаны в экспериментах CASP5 и CASP6. Поощренные этими многообещающими результатами, мы произвели модели для всех больших семей белка длиной меньше 150 аминокислот.
Рисунок 3: первое, близкое к разрешению атомного уровня, слепое ab initio предсказание структуры - CASP6 T281. Методология обработки с высоким разрешением, описанная в тексте, произвела образцовый 1.5-Å RMSD от кристаллической структуры (левая группа), с аспектами естественной упаковки боковой цепи (правая группа).
Изображение: Фил Брадлей (Phil Bradley) |
Основным моментом CASP6 было первое de novo слепое предсказание, которое использовало нашу методологию обработки с высокой разрешающей способностью, чтобы близко достигнуть точности с высокой разрешающей способностью. Относительно короткая последовательность (76 остатков) позволила нам применять нашу методологию все-атомной обработки не только к естественной последовательности, но также и к последовательности многих гомологов. Центр группы структур с самой низкой энергией, как оказалось, был удивительно близок к естественной структуре (1.5 Å; рисунок 3). Протокол обработки с высоким разрешением уменьшил RMSD с 2.2 Å до 1.5 Å, а боковые цепи упаковываются в ядре белка в манере, отчасти подобной естественной (рисунок 3, правая группа).
Мы расширили стратегию ab initio Розетты для предсказания структуры на проблему использования ограниченных экспериментальных данных, чтобы произвести модели белков. Включая химическое смещение и информацию NOE и более позднюю информацию двухполюсного сцепления в процедуру генерации структуры Розетты, мы были в состоянии произвести намного более точные модели, чем с предсказанием одной структуры ab initio или используя те же самые ограниченные наборы данных с методологии генерации структуры обычным ядерным магнитным резонансом (ЯМР). Захватывающяя недавняя разработка состоит в том, что процедура Розетты может также использовать в своих интересах неназначенные данные ЯМР и следовательно обойти трудный и утомительный шаг назначения спектров ЯМР.
Метод ab initio структурного предсказания Розетты, ЯМР метод определения структуры на базе Розетты, и новый метод для сравнительного моделирования, которые используют de novo подход Розетты для моделирования части структуры (прежде всего длинные петли), которые не могут быть смоделированы точно, основаны на шаблоне структуры гомолога, были все осуществлены в общественном сервере по имени Robetta. Этот сервер, который имеет постоянное отставание пользователей во всем мире, был одним из лучших среди всех полностью автоматизированных серверов предсказания структуры в тестах CASP6 и CASP5.
Предсказание белок-белковых взаимодействийВ течение множества лет мы воздействовали на обработку структуры белка - стимулирующая проблема из-за большого количества степеней свободы. Мы заинтересовались белок-белковой стыковкой потому, что два партнера, приблизительно, не подвергаются существенным конформационным изменениям в течение стыковки, место, которое будет обследовано - шесть степеней свободы твердого тела в дополнение к степеням свободы боковой цепи - является намного меньшим. В то время как это само по себе важно, эта проблема - хороший твердый шаг к более сложной проблеме обработки структуры.
Мы разработали новый метод, чтобы предсказать белок-белковые комплексы из координат несвязанных мономерных компонентов. Этот метод реализует твердотельный, с низким разрешением, поиск Монте Карло, сопровождаемый одновременной оптимизацией смещения основы и устройств боковой цепи с процедурой минимизации Монте Карло и физической моделью, используемой в нашей работе предсказания структуры с высокой разрешающей способностью. Одновременная оптимизация степеней свободы боковой цепи и твердого тела контрастирует с большинством других текущих подходов, которые моделируют белок-белковую стыковку как проблему соответствия формы твердого тела, с боковыми цепями, хранящимися установленными. Мы недавно улучшили метод (RosettaDock), разработав алгоритм, который позволяет эффективное осуществление выборки не-ротамер устройств боковой цепи во время стыковки.
Рисунок 4: Результаты белок-белковой стыковки КАПРИ (критическая оценка предсказанных взаимодействий). Суперпозиция структур предсказанного (синий) и рентгеновского (красный и оранжевый) белкового комплекса. Зеленый - боковая цепь, устройство которой было правильно предсказано, чтобы измениться после сложного формирования. Верхняя группа, целый комплекс. Нижняя группа, детали интерфейса. В дополнение к ориентации твердого тела, устройства большинства боковых цепей предсказаны правильно.
Изображение: Ора Фурман (Ora Furman) |
Сила RosettaDock была выдвинута на первый план в недавнем соревновании КАПРИ по слепой белок-белковой стыковке, которое было проведено в декабре 2004г. В КАПРИ предсказателям дают структуры двух белков, известных, что они формируют комплекс, и предлагают предсказать структуру комплекса. Предсказания RosettaDock для целей без существенных конформационных изменений основания были поразительны, как показано на рисунке 4. Были не только ориентации твердого тела двух партнеров, предсказанных почти совершенно, но также и почти все боковые цепи интерфейса были смоделированы очень точно. Эти правильные модели ясно выделились энергетически ниже, чем все другие модели, которые мы произвели, что предполагает, что потенциальная функция достаточно точна.
Эти многообещающие результаты предполагают, что данный метод может скоро стать полезным для того, чтобы произвести модели биологически важных комплексов из структур изолированных компонентов, и более широко предполагают, что моделирование с высокой разрешающей способностью структур и взаимодействий является в пределах досягаемости. Ясная цель для нашей работы предсказания мономерных структур состоит в том, чтобы достичь уровня точности этих моделей.
Улучшение физической моделиНаш текущий подход в улучшении энергетических функций вовлекает комбинацию квантовых химических вычислений на простых образцовых составах, традиционных подходах молекулярной механики, и анализа белковых структур. Мы использовали такой подход, чтобы разработать улучшенный потенциал водородной связи. Особо известный результат состоит в том, что зависимость ориентации водородной связи в квантовых химических вычислениях на формамидных димерах является удивительно похожей на замеченную в водородных связях боковая цепь - боковая цепь в структурах белка, но отличной от этого в силовых полях в текущей молекулярной механике, которая пренебрегает ковалентным характером водородной связи. Обратная связь от вычислений предсказания и проектирования обеспечила непрерывный стимул и руководство для улучшения энергетической функции; например, несоответствия в нашей обработке белок-белковых взаимодействий привели к недавнему развитию ротамер-базирующейся модели для установленных водой водородных связей.
Планы на будущееНаши методы предсказания и проектирования теперь достигли пункта, где они могут быть применены к важным биологическим проблемам. Особенно обнадеживает после годов работ над моделированием с высоким разрешением близость к предсказаниям с атомарным разрешением структур комплексов в КАПРИ (рисунок 4), вновь предсказание 1.5-Å в CASP6 (рисунок 3), и близкое согласие для TOP7 (рисунок 1, справа) и проектных моделей белок-белкового интерфейса (рисунок 1, слева) с рентгенокристаллическими структурами. Эти результаты говорят о том, что моделирование с высоким разрешением начинает работать.
За следующие несколько лет, мы стремимся улучшать и расширять наши методы. Мы особенно сосредоточены на улучшении точности предсказания структуры с высокой разрешающей способностью (которая требуется, если модели должны быть вообще полезными). Чтобы достичь этого, мы будем работать, чтобы улучшить основную физическую модель и методологию осуществления выборки. Мы также развиваем улучшенные методы, чтобы предсказать и перепроектировать специфику взаимодействия белок-ДНК, и расширяем нашу методологию проектирования белка на проектирование ферментов, которые катализируют химические реакции, не катализируемые белками естественного происхождения.
| | |
